免疫熒光技術有兩種檢測方法：用熒光標記抗體示蹤或檢測相應抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光標記抗原示蹤或檢測相應抗體的方法稱熒光抗原法。其中以熒光抗體方法較常用。

    1.在開始實驗研究前，有哪些因素需要考慮？

    1.1根據抗原選擇合適的抗體：確認抗原可以識別哪一種異構體以及抗原表位的位置。

    1.2確認您的目的蛋白在該樣本中是否表達（這里需要用到陽性對照）。

    1.3根據您所要研究的目標蛋白來確定合適的樣本類型（石蠟切片、冰凍切片還是細胞制備物等）。

    1.4選擇抗體時需要考慮該抗體的物種交叉反應；

    1.5關于蛋白，您需要考慮它的組織定位和細胞定位，以及染色時是否應該有信號。

    1.6選擇合適的固定方法及抗原修復方法。

    1.7抗體的工作濃度或稀釋比例，以及抗體的物種來源也是需要考慮的重要因素。

    2.免疫組化實驗里為什么要對樣品進行處理？

    樣品處理是為了調控樣本中蛋白的表達水平。如果是細胞實驗，我們可能需要使用適當的抑制劑或激活劑來上調或下調細胞中某種蛋白質的表達。如果是體內實驗，我們需要考慮更多的因素，因為實驗對象是活的實驗動物。在選擇抑制劑或激活劑、激動劑或拮抗劑時，應盡量避免由于非特異性結合其它蛋白所導致的非特異性效應。對于某些特殊試驗樣品，比如腦，我們需要確保細胞的滲透性，讓化合物能真正進入細胞或血腦屏障。另外需要確保所使用的化學品能夠溶于合適的溶劑。還有確定*適合的給藥途徑（注射或口服）。完成上述所有步驟之后，您就可以獲取組織或細胞樣品了。

    3.請問如何根據具體的實驗對象來選擇不同的樣本形式呢？

    對于細胞制備物，它們常見的形式是涂片或培養的細胞系。對于組織樣本，*常用的是石蠟包埋的組織切片，福爾馬林固定。原因是它們能夠保持組織形態與蛋白抗原性之間的*佳平衡。石蠟包埋的組織切片很穩定，并且易于使用。但它的不足之處是很耗時（需要對切片進行脫蠟處理和抗原修復）。一般來說，石蠟切片適用于 4 微米厚的切片。如果切片厚度大于4微米，抗體可能會被困住，導致假陽性染色，這是我們需要避免的。

    另一種常見的樣本形式是冰凍組織切片（IHC-FR），這對于不能經受醛固定處理和石蠟處理的抗原來說非常理想。因此這些抗原將呈現出更天然的狀態。但冰凍切片的缺點是組織形態可能不佳，與石蠟切片相比，冰凍切片可能沒那么好看。冷凍切片通常也僅適用于厚度為 4 到 10 微米的薄切片，超過這個厚度的切片可能會困住抗原，導致假陽性染色結果。如果您所要研究的組織類型無法做成這種厚度的薄切片，可以考慮采用漂片。該技術一般用于腦組織和脊髓，在發育研究中，這是一項非常有用的技術。該技術可用于厚度達 40 微米的更大切片。它的缺點是操作起來更加不便，整個過程中組織樣品都處于自由漂浮狀態，*后還必須將它們固定在載玻片上進行觀察，操作有一定的難度。它的另一個缺點就是非常耗時，尤其是應用于神經科學研究時，動物用 BFA 灌注，這顯然也是有難度的一步。

原創作者：上海恒遠生物科技有限公司